Javascript er ikke aktivert i din nettleser. Dette er nødvendig for å bruke Oncolex. Kontakt din systemadministrator for å aktivere JavaScript.

DNA-ploidiundersøkelse ved hjelp av bildecytometri


Fagansvarlig Håvard E. Danielsen
Prof. Ph.D.(med)
Radiumhospitalet

Oslo universitetssykehus HF

Generelt

DNA-ploidiundersøkelse defineres her til arbeidsgangen fra utvelgelse av tumorområde fra en parafininnstøpt tumorblokk, snitting, preparering, Feulgen-farging, måling, redigering til DNA ploidiklassifisering.

DNA-ploiditet er en cytogenetisk benevnelse som angir antall kromosomsett (n) eller avviket fra det normale antall kromosomer i en celle eller art. I cytometri brukes uttrykket enten for å beskrive DNA-innholdet i en celle (c) eller den totale DNA-fordelingen i en cellepopulasjon.

Bildecytometri baseres på Feulgen-teknikken, som er en mye brukt fargeprosedyre innen biologi. Man utnytter Schiff- eller Schiff-lignende reagensers binding til aldehydgrupper frigjort fra DNA-molekyler etter hydrolyse med saltsyre. Dette gjør det mulig å farge DNA in situ. Fargeintensiteten er proporsjonal med DNA-konsentrasjonen, og mengden av DNA i kjernen utrykkes som lys absorbert av Feulgen-fargen i hele kjernen.

Feulgen-reaksjonen benyttes for å kvantifisere DNA-mengde i tumorkjerner. Et digitalt kamera tar bilder av kjernene i prøven. Ved hjelp av programvare segmenteres enkeltkjerner, og bildene kan deles opp i bildeelementer (picture elements – pixels) . Gråtoneverdien til hver pixel representerer intensiteten av DNA-spesifikk farging (0=svart, 1023=hvitt). Den relative mengden DNA i hver kjerne (DNA-ploidi) fremkommer ved å summere den optiske tettheten til alle pixlene i kjernen. Optisk tetthet og integrert optisk tetthet (engelsk: Integrated Optical Density – IOD) er definert slik:

 

Under en DNA ploidimåling blir IOD-verdiene til alle kjernene i prøven registrert og kan framstilles grafisk i et histogram (x-akse: IOD-verdi, y-akse: antall kjerner).

Rutinemessige, kliniske DNA-ploidiundersøkelser gjøres i dag hovedsakelig på materiale fra flere typer gynekologisk kreft, samt på graviditetsprodukter hvor man mistenker partiell eller komplett mola.

Mål

Målet med undersøkelsen er å kunne prognostisere pasienten basert på DNA innhold i den enkelte pasient sin kreftsvulst, samt bidra til diagnostisering av partiell versus komplett mola. Analysesvaret kan deretter benyttes til å gi den enkelte pasient målrettet behandling.


Utstyr

Bruk beskyttelseshansker ved snitting, preparering og farging. Preparering fram til skylling, samt Feulgen-farging foregår i avtrekksskap.

Standardutstyr til snitting og farging av snitt

Preparering

  • Spissbunnede sentrifugerør med kork, 10 ml, 2 pr. prøve
  • Glasspipetter for xylol, for andre løsninger kan plastpipetter benyttes
  • Prøveglass m/lokk, 10 ml, 1 per prøve  
  • Sentrifuge
  • Cytospin-sentrifuge med utstyr   
  • 60 µm nylonfilter
  • Polysin-glass
  • Magneter (VWR, 3 x 8 mm)

Magnetrører (Assistent, 2070/100)

Måling og redigering

Målinger foregår på eget rom med dempet belysning og minimale rystelser.

  • Programvare for bildecytometri/DNA-ploidi (PWS Grabber, Room4, Ltd)
  • Monokromatisk digitalt kamera AxioCam med et båndpass-filter (Zeiss)
  • Mikroskop, AxioImager A1/A2, 40x objektiv u/immersjon (Zeiss)
  • Fokuseringsenhet (Physik Instrumente)
  • Motorisert objektbord (Prior Scientific)
  • PC med skjerm

Kjemikalier

  • Aluminiumkaliumsulfat (kalialun, KO8S2Al, 12H2O )
  • Schiff`s fuchsin-sulfite reagent (Sigma-Aldrich)
  • Iseddik (etansyre)
  • Eosin
  • Etanol (absolutt og 96 %)
  • Eukitt
  • Hematoxylin
  • Kaliumdisulfit (K2S2O5)
  • Medisinsk kull
  • Natriumdisulfitt (Na2S2O5)
  • Natriumjodat (NaJO3)
  • PBS (fosfatbuffer)
  • Protease (type VIII, bacterial, Sigma P5380)
  • Saltsyre p.a. (HCl)
  • Xylol 

Løsninger

Standardløsninger

Standardløsninger blandes i god tid og brukes i ulike prosedyrer.

Eosin

  • 1,25 g eosin løses i 1000 ml 80 % etanol
  • Tilsett 2,5 ml iseddik
  • Løsningen røres

5 molar saltsyre

  • 292 ml destillert vann
  • 208 ml konsentrert saltsyre (37 %)

Hematoxylin (Mayers)

  • 100 kalialun løses i 2000 ml destillert vann
  • Tilsett 4 g hematoxylin
  • Tilsett 0,4 g natriumjodat for modning
  • Løsningen står til neste dag på magnetrører
  • Filtrer 200 ml og tilsett 4 dråper iseddik
  • Hell løsningen over i fargeskål
  • Filtrer løsningen hver gang før bruk
  • Tilsett mer iseddik ved påfyll av mer løsning

Ferske løsninger

Ferske løsninger skal være ferske og blandes ut underveis.

Protease-løsning (0,05 %)

  • 10 mg protease løses i 20 ml PBS

Sulfittløsning

  • 1 gram natriumdisulfitt i 190 ml destillert vann
  • Tilsett 10 ml 1 molar saltsyre
  • Dette er nok til ett rifleglass.

Gjennomføring

Bildecytometri, prøvetaking og registrering

Vevsprøver til DNA ploidiundersøkelse blir innkalt fra eksternt eller eget sykehus. Prøvene rekvireres av lege. En patolog undersøker hematoxilin og eosin fargede snitt fra de aktuelle operasjonspreparatene og velger ut en eller flere blokker som er aktuelle for analyse. Tumorområdene markeres på snittene . Blokkene og tilhørende snitt hentes.

Snitte-protokoll

  • Fra hver utvalgt blokk tas 1–3 snitt av 50 µm tykkelse. Antall snitt som tas avhenger av størrelsen på tumorområdet.
  • Avslutningsvis tas et tynnsnitt som merkes HE2 og farges med hematoxilin og eosin. Alle objektglass skal påføres minst to forskjellige identifikasjoner.

HE2-snittet leveres til lege for kontroll av tumorvev .

Monolayerpreparering av 50 mikrometer tykke parafinsnitt

Preparering skal gjøres i avtrekk. Xylol-rester skal kastes i egen beholder. Observer prøven nøye, vær forsiktig ved fjerning av all væske, for å unngå å miste prøvemateriale. Unngå krysskontaminasjon ved å benytte en pipette for hver prøve.

  • Fjern parafin ved å tilsette 4 ml xylol i prøveglasset. La stå i 15 minutter. Fjern xylolen og gjenta.
  • Fjern xylolen ved å tilsette 4 ml absolutt etanol. La stå i 5 minutter. Fjern etanolen.
  • Rehydrering skjer ved å tilsette 4 ml 96 % etanol til hver prøve. La stå 5 minutter. Tilsett så med 2 minutters intervaller  2 ml destillert vann (konsentrasjon av etanol blir etter hver tilsats  74% og 50%). Hell hver prøve over i spissbunnende sentrifugerør. Sentrifuger i 10 minutter ved 1500 rpm (127G).
  • Skylling: Fjern etanolen og tilsett 4 ml PBS. Sentrifuger i 5 minutter ved 1500 rpm (127G) og fjern supernatant. Gjenta dette.
  • Under enzymbehandling skjer frigjøringen av enkeltceller Tilsett 1 ml enzymløsning og en magnet til hver prøve. Prøvene plasseres i stativ på magnetrører. Prøvene ristes i romtemperatur i 60-70 minutter, avhengig av vevstype. 
  • For å stoppe enzymaktiviteten: Sett prøvene på is og tilsett 4-8 ml nedkjølt PBS. Filtrer suspensjonen gjennom 60 µm nylonfilter over i et nytt rør. Sentrifuger ved 2200 rpm (800 G) i 20 minutter. Fjern supernatant, og tilsett 1-2 ml PBS (vurderes i forhold til pellett). 
  • Spinn: Pipetter riktig mengde kjernesuspensjon i prøvekamrene. Dette er basert på erfaring. Første prøvespinn vurderes ufarget i mikroskop. Ved 40x objektiv bør det være minst 30-40 kjerner i synsfeltet. Sentrifuger ved 600 rpm (40 G) i 5 minutter. Nedbremsing skal skje langsomt. Lag minimum 2 spinn for hver prøve. Ferdige monolayere postfikseres i 4 % bufret formalin minimum over natten, men kan stå over helgen.
  • Farg spinnene ved Feulgen-farging.

Feulgen-farging av monolayer

  • Prøvene etterfikseres i 4% formalin over natt, før de skylles forsiktig i vann.
  • Prøvene hydrolyseres i 5 molar saltsyre i 60 minutter. NB! Tiden kan variere med prøvemateriale, og det lages hydrolysekurve for forskjellige vevstyper for å fastslå riktig hydrolysetid. Tøm ut saltsyren i egen beholder. Fyll og tøm rifleglass med prøver med destillert vann x 3.
  • Farging: La objektglassene stå mørkt i Schiffs reagens i 120 minutter. Reagenset tømmes i utslagsvask. Fyll og tøm rifleglasset med destillert vann x 3.
  • Sulfittskyll: Skyll 3 x 10 minutter i sulfittløsning. Skyll til slutt 5 minutter i rennende vann.
  • Dehydrering: Flytt glassene over i metallstativ og skyll i destillert vann, 70 % etanol, 96 % etanol, 2 x absolutt etanol. Skyll i xylol x 2.

Dekkglass monteres med eukitt fra xylol.

Automatisk måling av monolayer

  • Finn det beste (kjernetett, men uten mange overlappende kjerner) preparatet, legg det i posisjon på mikroskopet og fokuser prøven.
  • Start måleprogrammet PWS Grabber vs 1.4.12, skriv inn brukernavn og angi hvor mange prøver som skal måles. Legg inn prøvenavn og lagringsted, og trykk deretter OK. Fokus, bakgrunnsbilde og lysintensitet sjekkes først for prøve nummer 1, deretter fokuseres prøve 2-4 ved hjelp av en ”slide-bar” i programmet. Når bakgrunnsbilder og fokus er justert, trykker man start og det angitte antall objekter blir målt. Når prøven er ferdig målt trykker man exit, og overfører måledata til ønsket sted.

Redigering av automatisk måling

  • Åpne PWS Classifier, og ved å trykke ”open” åpnes den aktuelle prøven for redigering.
  • Det anbefales at galleriene sorteres etter areal før vurdering og redigering, samt at ”Original image” velges under ”Image selection”.

Mål for redigeringen:

  • Galleri 1: Tumorkjerner (hovedgalleri)
  • Galleri 2: Lymfocytter (delvis referansegalleri)
  • Galleri 3: større immunkjerner (referansegalleri)
  • Galleri 4: fibroblaster (delvis referansegalleri)
  • Galleri 5: Kjerner med uklar egenskap
  • Galleri 6: Ekskluderte kjerner

Følgende kjerner ekskluderes:

  • Kuttede kjerner (mikrotom)
  • Kjerner, av andre årsaker, uten intakt membran
  • Overlappende kjerner
  • Nekrotiske og apoptotiske kjerner
  • Kjerner med fremmedlegemer over seg
  • Kraftig over- eller under-segmenterte kjerner

Prøven redigeres ved å flytte uønskede objekter fra Galleri 1-4 til Galleri 6. Kjerner som er feilplassert flyttes til ønsket galleri. Når prøven er ferdig redigert trykker man ”save” for å lagre redigeringen.

Klassifisering av DNA-histogram

Klassifisering av DNA-histogram gjøres på grunnlag av ferdig redigerte gallerier i PWS Classifier. Man går gjennom de ulike galleriene for å verifisere redigeringen av prøven. Histogrammet åpnes ved å trykke på histogram-knappen. Vurder sammensetting/plassering av de ulike kjernetypene og angi 2c-toppen (diploid G1-topp). Avmerk hver potensielle G1-topp og be om data for den angitte populasjonen (merkelapp på histogram).

Merkelapp:

  • Gjennomsnittlig IOD-verdi (Integrated Optical Density).
  • CV (variasjons-koeffisient)
  • DI (DNA-Indeks) 
  • Toppens prosentandel av totalt antall tumorceller
  • 5c ER (Exceeding Rate)
  • 9c ER

Histogrammet klassifiseres så i en av fire mulige kategorier:

  • Diploid: Det er en normal mengde (23 kromosompar = duplikat sett) DNA i cellekjernene. Dette er normalsituasjonen under hvilefasen i cellesyklusen.
  • Tetraploid: DNA-innholdet i cellekjernene er doblet. Normal situasjon i f.eks. levercellekjerner og i G2-fasen før mitosen.
  • Polyploid: Det skjer en videre dobling av DNA-innhold i cellekjernen uten en celledeling (åtte kopier av hvert kromosom). Generelt brukes polyploid som benevnelse på kjerner der det finnes flere kopier av celle-DNA.
  • Aneuploid: DNA-innholdet i cellekjernene har ikke blitt likt fordelt under celledelingen. Kromosomer kan mangle delvis eller i sin helhet, eller det kan ha blitt lagt til hele eller deler av kromosomer.

På grunn av stadige forbedringer av teknisk kvalitet, er klassifiseringskriterier stadig i drift og internasjonale konsensus-kongresser avholdes med jevne mellomrom (1). Følgende er å betrakte som gjeldende kriterier for DNA-ploidi klassifikasjon:

  • DIPLOID
    • Kun en G0/G1-topp
    • G2-topp er under 10 % eller mindre enn SFF (S-fasefraksjon)
    • 5c ER er mindre enn 1 %
  • TETRAPLOID
    • Topp ved 4c, 8c og DI 1,9-2,1 (dersom DI er 1,8-1,9 eller 2,1-2,2 benyttes regel om ± 2xCV).
    • 4c er over 10 % (og større enn SFF) eller påviselig SFF/G2 for 4c-toppen er over 1 %.
  • POLYPLOID
    • Topp ved 8c, 16c og DI 3,8-4,2 (dersom 4c har høy CV er DI-grense 3,6-4,4).
    • 8c er over 10 % eller påviselig SFF/G2 for en 8c-topp er over 1 %.
  • ANEUPLOID
    • Non-euploid G1-topp (euploid: 2c, 4c, 8c, osv.)
    • 5c/9c ER er større enn 1 % og ikke representerer euploide populasjoner

Referanse
Haroske G, Baak JP, Danielsen H, Giroud F, Gschwendtner A, Oberholzer M, Reith A, Spieler P, Bocking A. Fourth updated ESACP consensus report on diagnostic DNA image cytometry. Anal Cell Pathol. 2001 23(2):89-95.


Prosedyrer i Oncolex kan ikke erstatte faglig veiledning fra kvalifisert veileder. Den som følger prosedyrene har et selvstendig ansvar for at det foreligger nødvendig godkjenning, lisens eller autorisasjon.
Oslo universitetssykehus HF © 2017